00:04

Долгая дорога к нейрону



ЭС-клетки с генетически модифированным геномом. Свечение EGFP под контролем эндогенного промотора маркера нейронов, бета-тубулина класса III (зеленый); окраска антителами на белок NF200, маркер нейронов (красный); окраска ДНК с помощью DAPI (синий)

"Есть большая цель, которую мы достигнем, конечно, только в отдаленной перспективе, — это лечение нейродегенеративных заболеваний», — начинает рассказ Алексей Мензоров, научный сотрудник лаборатории генетики развития ИЦиГ СО РАН. — Существуют болезни, при которых страдает определенная группа нейронов, и мы хотели бы их заместить". В идеале картина выглядит так: в мозг пациента вводят новые клетки, которые берут на себя функции умерших. Однако это гораздо легче сказать, чем сделать. Во-первых, вводить уже готовые нейроны практически очень сложно и, скорее всего, они не приживутся. Во-вторых, чтобы их ввести, их надо откуда-то взять, а взрослые нейроны, как известно, не делятся.

Ответом на эти сложности могут стать стволовые клетки, и в первую очередь эмбриональные стволовые клетки (сокращенно ЭСК) — особый класс клеток, которые обладают способностью превращаться в клетки любых тканей организма. В лаборатории генетики развития проводится целый класс работ, связанный с ЭСК мыши. Хотя они преследуют разные задачи, одна проблема у них общая.

«Мы планируем из ЭСК получить нейроны, ввести их мышке в мозг и посмотреть, будут ли они там работать, — поясняет Алексей Мензоров. — Но есть одна проблема — эти нейроны надо как-то пометить».
Распространенный способ отличать одни клетки от других заключается в том, чтобы встроить в геном специальный новый участок, кодирующий образование флуоресцентного белка. При облучении ультрафиолетовым светом этот белок будет светиться зеленым или красным цветом. Но если просто отправить внутрь стволовой клетки кусок такой белок-кодирующей ДНК, то она будет светиться вне зависимости от того, превратится потом эта клетка в нейрон или во что-то другое. Поэтому в ИЦиГ была разработана система, которая позволяет «включить» синтез белка только в том случае, если исходная стволовая клетка либо начала превращаться в нейрон, либо уже стала им.

Хотя набор генов в живом организме в принципе один и тот же для всех тканей, клетки разных видов различаются тем, какие именно гены в них «работают» и какие белки синтезируют. Для нейронов, например, таким маркером был выбран участок генома, кодирующий белок бета-тубулин класса III, а для клеток — предшественников нейрона был выбран белок нестин.

Система, которую и разработали, и используют в ИЦиГ, заключается в том, что ДНК вначале разрезается в определенном месте, затем в ядро вводится плазмида с необходимой последовательностью, которая встраивается в разрезанную ДНК. Затем ДНК склеивается, но теперь получается так, что при синтезе бета-тубулина или нестина вместе с ними будет включаться сборка и флуоресцентных белков-маркеров. Таким образом, если ЭСК начинает превращаться в нейрон — она начнет светиться. Если развитие пойдет по другому пути, то флуоресценции не будет.

«Мы хотим — и продвигаемся к тому, чтобы на мышиной модели получить нейроны, которые мы могли бы по зеленой флуоресцентной метке отбирать и следить, как они участвуют в лечении поврежденного мозга мыши, — объясняет Алексей Мензоров. — Сейчас мы получили ЭСК, которые, во-первых, в культуре могут сами превратиться в нейроны и, во-вторых, из которых мы можем получить трансгенную мышь».
Начальный материал берется из SPF-вивария института. Исследователи отбирают эмбрионы мышей на ранней стадии развития, получают из них ЭСК, вводят в них нужный участок генома и получают культуру клеток. Потом эти клетки проходят проверку на «нормальность» — правильное ли число хромосом. И затем, когда эта проверка пройдена, с такими клетками можно уже работать.

Одно из направлений — начинать превращать их в нейроны с помощью определенных веществ. Далее эти нейральные стволовые клетки — то есть СК, которые могут превратиться только в нейроны, но нейронами пока не являются, — пересаживают подопытным мышам на стадии эмбриона либо в первые дни после рождения. У взрослых мышей, как уточняет исследователь, для этого вначале надо вызвать некоторое повреждение мозга, — тогда есть шанс, что вновь введенные СК будут участвовать в «починке».

Другая, не менее интересная работа, — пересадка «меченых» ЭСК непосредственно в эмбрион мыши на стадии бластоцисты, когда весь организм будущего мышонка состоит всего из сотни клеток. Получается, по словам Алексея Мензорова, «химера», «составная» мышь, поскольку она развивается не только из клеток своих родителей, но и из пересаженных.

Если эксперимент идет нормально, то новые меченые клетки начинают делиться и постепенно превращаться в клетки разных тканей мыши. Часть из них позже превратится в гаметы — половые клетки, и, таким образом, потомство этой мыши будет трансгенным, нейроны будут «светиться» зеленым в ультрафиолетовых лучах.

Светящаяся мышь, конечно, интересна и сама по себе, но цель этой сложной процедуры состоит в том, чтобы получить животное, все клетки которого содержат ген, который может синтезировать зеленый флуоресцентный белок. Хотя он присутствует фактически везде, «включаться» будет только в нейронах.

Между тем, относительно недавно стало известно, что в нейроны можно превратить не только ЭСК, но и, например, клетки кожи — фибробласты, если воздействовать на последние определенными генетическими манипуляциями. Однако как проверить, что новая клетка — это именно нейрон? Ответит как раз зеленый флуоресцентный белок, синтез которого запустится только в нейроне.

Конечная цель этой большой и кропотливой работы — «увидеть», что происходит с нейронами, как они развиваются и как реагируют на пересадку в организм мыши. Исследования проводятся в большой коллаборации, совместно с Новосибирским государственным университетом и Сколковским институтом науки и технологий.

Источник

Просмотров: 440
Рейтинг: 5.0/1
Добавлено: 22.06.2014

Темы: нейрофизиология, эмбриональные стволовые клетки, Нейрон, долгая дорога к нейрону, открытия, как устроен мозг, наука
Всего комментариев: 0
Добавлять комментарии могут только зарегистрированные пользователи.
[ Регистрация | Вход ]